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近年来发展起来的1H—1H和1H—13C COSY等二维核磁共振谱已应用在灵芝三萜结构的测定中。
5.旋光光谱：旋光光谱主要是解决绝对构型问题，从文献报道的CD谱数据总结出CD谱与绝对构型关系；凡是具有[I]式绝对构型者，C7为羟基，不管3位或15位是羟基或羰基取代，CD谱都呈现下列Cotton效应，（290～295）nm（—），（248～257）nm（+），（207～217）nm（—）；凡是在[I]式结构中C7为酮基者，则不管3位或15位的取代基如何，都呈现如下Cotton效应：（305～307）nm（—），（272～278）nm（+），（253～256）nm（—），（225～231）nm（+）。
Nishitoba等人在鉴定epoxyganoderiol A的绝对构型时，应用CD谱确定了C24和C25的绝对构型。在epoxyganoderiol A的侧链上存在着一个环氧基团，为了确定24和25位是S还是R，首先以羊毛甾醇为原料，经反应得到S和R两种构型的化合物，反应如下：
a)AC2O/pyridine, b) SeO2/dioxane, c) NaBH4/CeCl3·7H2O/MeOH-THF
d)(+)-DETor (-) -DET/Ti (O1Pr) 4/TBHP/CH2Cl2
分别将7b和7a溶于CCl4溶液中，加入Eu（fod）3络合物，测其旋光谱，得到如下结果：
以上两个化合物的CD谱的Cotton效应是与C25的Newman投影相一致的。正Cotton效应为25S负Cotton效应为25R。在相同条件下测epoxyganoderiol A的CD谱，显示313nm（△ε+10.9）为正Cotton效应，证明25位的绝对构型为S，通过测定NOE，证实24位绝对构型为S。
（三）结构测定中的化学反应
随着仪器分析新技术、新方法的发展，各类谱学方法和X射线—衍射等分析手段已在结构测定中得到了广泛的应用。经典的化学方法与仪器分析相结合，使三萜化合物的结构测定快速而准确并达到了微量的水平。化学反应常用于证实分子骨架中取代基类型、数目、位置及构型等。
1.氧化反应 氧化反应主要用来确定分子中所含羟基、羰基或酰基的数目和位置等。应用较多的是将羟基氧化成羰基，比较常用的是铬酐—吡啶的方法，也有将铬酐溶于AcOH中搅拌加入样品中，室温下搅拌2h，用水稀释，氯仿提取，提取液经水洗干燥浓缩后经薄层制备而得到氧化产物。
2.酰化反应 酰化反应对于确定分子中羟基的数目、性质、构型很有帮助，常用的乙酰化反应，通常采用醋酐—吡啶室温处理的方法。
3.水解 由于部分灵芝三萜酸中带有乙酰基，为确定乙酰基的存在和数目，采用了水解的方法，如Komoda将ganoderic acid F溶于甲醇，用5%Na2CO3室温处理3h后，用2mol/L HCl酸化，除去甲醇后用CHCl3萃取，水洗CHCl3液后Na2SO4干燥，蒸干。通过TLC制备得水解产物。
4.还原 还原反应主要用来确定分子中有无不饱和双键及羟基、羰基、取代基的位置。如Nishitoba等人在确定lucidenato G结构时，为了证实C26位上存在着羟基，先将lucidenate G甲基化，然后再用NaBH4进行还原，得到其丙酮化物，从而证实了C26位存在着一个羟基。
第二节 多糖类化合物
多糖类化合物是灵芝所含化学成分之一，现已证明，灵芝多糖类具有抗肿瘤作用、免疫调节作用、降血糖作用、降血脂作用、抗氧化作用和抗衰老作用，故灵芝多糖类是灵芝的主要有效成分。临床试验也证实，灵芝多糖可作为肿瘤化学治疗和放射治疗的有效辅助治疗药。有关灵芝多糖类的分离、纯化、结构确证的研究方兴未艾，迄今仍为国内外瞩目的重要课题。
一、灵芝多糖类的分离、纯化及鉴定
灵芝多糖类的分离、纯化及结构确证的方法及步骤可概括如下：多采用热水提取、分部沉淀的方式分离灵芝的多糖组分；进一步经各种层析如DEAE纤维素柱色谱、Sephadex G75柱色谱，凝胶过滤如Sepharose CL—4B凝胶过滤，高压电泳和聚丙酰胺凝胶电泳等处理可获纯化的多糖；后者经酸水解、纸色谱、气相色谱分析可确定其单糖组分，经酶水解可检测殊碳糖（anomeric）结构；经甲基化技术及Smith降解、气相色谱、气质联用、紫外及红外光谱分析、核磁共振等可确定多糖的连接方式和基本化学结构。多糖的分子量可通过凝胶柱色谱如SephadeaxG—100柱色谱、超离心测沉降系数等方法测定，一般在测得分子量范围后，求出平均分子量。
二、灵芝多糖类的理化特性
由于灵芝的种类、产地、分离提取方法各异，所获灵芝多糖的理化特性、分子量、单糖组分和连接方式不同，生物活性亦有差异。如Hiroshi等（1985）报道，赤芝子实体热水提取物经浓缩、透析及系列色谱后获得两种多糖ganoderan A和B。ganoderan A的分子量9 300，旋光度[α]D+58.8°，ganoderan B分子量3 600，旋光度[α]+33.3°，二者对小鼠均具降血糖作用。随后，他们又从赤芝子实体中分离出两个降血糖有效成分ganoderan B和C，均为糖肽，分子量分别为7 400和5 800。物理化学和化学研究证明，ganoderan B含吡喃葡萄糖酰基β-1→3主链和β-1→6侧链，ganoderan C则含D-吡喃葡萄糖酰基β-1→3和β-1→6连接和D-吡喃半乳糖酰基α-1→6连接。Mizuno等（1986）报告，赤芝子实体经85%乙醇（80℃），热水（100℃），3%草酸铵（100℃）和5%氢氧化钠（30℃）提取后，残渣再用5%氢氧化钠（含0.1%硼氢化钠，80℃），20%氢氧化钠（含0.1%硼氢化钠，30℃）和5%氯化锂（溶于二甲醋酸铵中，70℃）提取，获多糖组分A、B、C。A和B经乙醇分离，醋酸沉淀，Sepharose CL-4B凝胶过滤，得4个β-葡聚糖，其中I和II来自A，III和IV来自B。从C分离出脱乙酰壳多糖（chitosan）（V）。I—V经80%甲酸（85℃）处理可获相应的甲酰化多糖和低分子量多糖。I—IV主要由葡萄糖和少量的糖醛酸、木糖、甘露糖组成，并具β-（1→3）-D-葡聚糖主链和β-（1→6）葡萄糖基侧链，其分子量分别为330 000、60 000、160 000和110 000。不同之处是IV不含木糖，但含1.2%蛋白质。V经酸水解后，主要含葡萄糖胺，并含少量葡萄糖，经红外光谱和X射线分析证明为脱乙酰壳多糖。给小鼠腹腔注射II、III以及III的甲酸酯和I～IV的低分子量多糖均具有宿主中介性的抗肿瘤活性，半数抑瘤量（ID50）分别为42.5mg/kg、34.1mg/kg、70.2mg/kg、22.4mg/kg、17.0mg/kg、32.1mg/kg和25.8mg/kg。Mizuno等（1985）报告，赤芝子实体经水提取后，其残渣经3%草酸铵溶液（100℃）和5%氢氧化钠溶液（30℃）提取后，得2个水不溶多糖A和B。A经真空浓缩、透析、冻干，Shepharose CL-48凝胶过滤，获主要组分C。B用醋酸中和至pH5～6，得酸性异多糖D，加乙醇沉淀得糖蛋白E和另一种异多糖。C由酸性β-D-葡聚糖构成，含葡萄糖77%、葡萄糖醛酸10.3%以及少量的果糖、木糖、甘露糖和半乳糖，分子量10 000～30 000。D的分离程序同A，它含两个主要成分G和H，G和H均为酸性异多糖，分别含葡萄糖92%和95%，葡糖醛酸9.7%和13.0%以及少量果糖、木糖、甘露糖、乳糖，分子量70 000～100 000。给小鼠腹腔注射A—H对S180均具有抗肿瘤活性，50%抑瘤量为（6.3～26.3)mg/kg，但口服无效。1989～1994李荣芷、何云庆等先后报告，赤芝子实体经热水提取，乙醇分部沉淀、透析、除蛋白等步骤得灵芝多糖BN3A、BN3B、BN3C和GL-A、GL-B、GL-C。进一步经DEAE纤维素柱色谱分离，酶解，酸水解，过碘酸氧化，甲酸生成，Smith降解、气相色谱、高压液相色谱分析和光谱分析等从BN3B、BN3C、GL-A、GL-B和GL-C****分离鉴定了18个灵芝多糖均一体，其中5个肽多糖、4个葡聚糖，其余为杂多糖，其化学结构及分子量见表6-4。
表6-4 灵芝多糖的化学结构和分子量
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均一体 |
化学结构 |
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分子量 |
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BN3B |
BN3B1 |
β（1→6）β（1→3） |
葡聚糖 |
3.50×104 |
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BN3B2 |
β（1→6）β（1→3） |
阿拉伯半乳聚糖 |
4.00×104 |
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BN3C |
BN3C1 |
β（1→6）β（1→3） |
葡聚糖 |
1.62×104 |
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BN3C2 |
β（1→6）β（1→3） |
肽多糖 |
2.45×104 |
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GLA |
GLA2 |
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肽多糖 |
0.93×104 |
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GLA4 |
均以β（1→3）为主 |
杂多糖 |
1.33×104 |
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GLA6 |
含少量β（1→6）及β（1→4） |
肽多糖 |
1.28×104 |
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GLA7 |
以半乳糖、葡萄糖为主 |
杂多糖 |
1.20×104 |
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GLA8 |
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肽多糖 |
1.48×104 |
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GLB |
GLB2 |
β（1→4）为主，尚有β（1→6） |
葡聚糖 |
0.71×104 |
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GLB3 |
β（1→4）为主，极少β（1→6） |
甘露葡聚糖 |
0.77×104 |
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GLB4 |
β（1→4） |
杂多糖 |
0.90×104 |
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GLB6 |
β（1→4）含乙酰基 |
杂多糖 |
0.88×104 |
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GLB7 |
β（1→4）为主，尚有β（1→6） |
杂多糖 |
0.90×104 |
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GLB9 |
β（1→4）为主 |
半乳葡聚糖 |
0.93×104 |
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GLB10 |
β（1→4）β（1→6）含乙酰基 |
杂多糖 |
0.68×104 |
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GLC |
GLC1 |
β（1→4）少量β（1→6） |
肽多糖 |
0.57×104 |
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GLC2 |
β（1→4）少量β（1→6）含乙酰基 |
葡聚糖 |
0.60×104 |
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